光學顯微鏡基礎(chǔ)儀器光學系統(tǒng)

        光學顯微鏡基礎(chǔ)知識；顯微鏡的光學系統(tǒng) 顯微鏡的光學系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反射鏡和聚光鏡四部分。從廣義上講，它還包括光源、過濾器、蓋玻片和載玻片。 (1)物鏡物鏡是決定顯微鏡性能的最重要的部件。它安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，靠近被觀察物體，故稱為物鏡或連接物鏡。一、物鏡分類物鏡根據(jù)使用條件的不同，可分為干式物鏡和浸入式物鏡；浸沒物鏡可進一步分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用的放大倍數(shù)為90-100倍）。根據(jù)放大倍數(shù)的不同，可分為低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）和高倍物鏡（40-65倍）。根據(jù)像差校正情況，分為消色差物鏡（常用，可以校正光譜中兩種顏色的色差）和多色物鏡（可以校正光譜中三種顏色的色差的物鏡）。頻譜，這是昂貴且較少使用的）。光學顯微鏡 2、物鏡的主要參數(shù)：物鏡的主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。 ①.放大倍數(shù)是指人眼看到的圖像尺寸與相應(yīng)標本尺寸的比值。它是指長度的比例而不是面積的比例。示例：放大倍數(shù)為 100 倍，指長度為 1μm 的試樣。放大圖像的長度為100μm。如果按面積計算，則放大10000倍。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 ②.數(shù)值孔徑又稱透鏡孔徑比，簡稱NA或A，是物鏡和聚光鏡的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨率成正比。干物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95，油浸物鏡（雪松油）的數(shù)值孔徑為1.25。 ③.工作距離是指當被觀察的試樣清晰時，物鏡前透鏡底部到試樣蓋玻片頂部的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān)。物鏡焦距越長，放大倍數(shù)越低，工作距離越長。示例：10x 物鏡標有 10/0.25 和 160/0.17，其中 10 是物鏡的放大倍數(shù)； 0.25 是數(shù)值孔徑； 160為鏡筒長度（mm）； 0.17 是蓋板玻璃的標準厚度（以毫米為單位））。 10倍物鏡有效工作距離為6.5mm，40倍物鏡有效工作距離為0.48 毫米。光學顯微鏡 3. 物鏡的作用是對試樣進行次放大。它是決定顯微鏡性能的最重要的組成部分——分辨率的高低。分辨力也稱為分辨力或分辨力。分辨率的大小用分辨率距離（可分辨的兩個物點之間的最小距離）的值來表示。在明視距離（25cm），正常人眼可以看到相距0.073mm的兩個物點。這個0.073mm的值就是正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨率距離越小，分辨率越高，這意味著它的性能越好。顯微鏡的分辨力由物鏡的分辨力決定，物鏡的分辨力由其數(shù)值孔徑和照明光的波長決定。當使用普通*照明法（使光線均勻穿過試樣的明視照明法）時，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA，其中d為物鏡的分辨距離，單位為nm。 λ——照明光的波長，nm。 NA——物鏡的數(shù)值孔徑。例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25，可見光波長范圍為400-700nm，平均波長為550nm，則d=270nm，約為照明光波長的一半.一般可見光照射顯微鏡的分辨率極限為0.2μm。 (2)目鏡光學顯微鏡由于靠近觀察者的眼睛，所以又稱為目鏡。安裝在鏡筒的上端。 1、目鏡的結(jié)構(gòu)通常由上下兩組鏡片組成。上面的透鏡稱為眼透鏡，下面的透鏡稱為會聚透鏡或場透鏡。上下透鏡之間或場鏡下方安裝一個光闌（它的大小決定了視場的大?。?，因為標本只是在光闌表面成像，可以在這個光闌上粘一小塊頭發(fā)作為一個指針來指示某個特征的目標。目鏡千分尺也可以放置在其上以測量觀察到的樣品的尺寸。目鏡長度越短，放大倍數(shù)越大（因為目鏡的放大倍數(shù)與目鏡焦距成反比）。 2、目鏡的作用是將物鏡放大后清晰分辨的實像進一步放大到人眼能輕易分辨清楚的程度。常用目鏡的放大倍數(shù)為5-16倍。 3、目鏡與物鏡的關(guān)系 光學顯微鏡物鏡已經(jīng)過能分辨清楚的精細結(jié)構(gòu)，若不經(jīng)目鏡重新放大，達不到人眼能分辨的大小，則不清晰；但是物鏡無法分辨的精細結(jié)構(gòu)，即使用高倍目鏡重新放大，仍然看不清楚，所以目鏡只能放大，不會提高分辨率顯微鏡。有時雖然物鏡可以區(qū)分非?？拷膬蓚€物點，但兩個物點之間的像距小于人眼的分辨距離，仍然無法看清。因此，目鏡和物鏡是相互制約的。 (3) 集中器 集中器又稱集中器。位于樣品下方的冷凝器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明場聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗場聚光鏡。 1.光透鏡的主要參數(shù)數(shù)值孔徑（NA）是聚光鏡的主要參數(shù)，數(shù)值孔徑一般為1.2-1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通常是刻在上透鏡上的數(shù)字frame表示光圈值，通過調(diào)節(jié)下可變光圈的開度，可以得到低于這個數(shù)值的各種數(shù)值孔徑，以滿足不同物鏡的需要。一些聚光鏡由幾組透鏡組成。可以將最上面的一組透鏡移出或移出光路，使聚光鏡的數(shù)值孔徑更小，以適應(yīng)低倍物鏡觀察的照明。光學顯微鏡 2. 聚光鏡的作用 聚光鏡相當于一個凸透鏡，它會聚光以增強試樣的照度。一般聚光鏡的聚光焦點設(shè)計在上透鏡平面上方1.25mm左右。 （焦點在待觀察的標本上，載玻片的厚度約為1.1mm） 3. 虹膜隔膜又稱虹膜。它位于冷凝器下方，由十幾個金屬片組成，中間有一個圓孔。它的作用是調(diào)節(jié)光強，使聚光器的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)。光圈開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察后應(yīng)將光圈調(diào)到）。在虹膜下方，有一個圓形濾光片支架。注：中學實驗室僅教師用顯微鏡（1600×或1500×）配備聚光鏡，學生用顯微鏡（640×或500×）配備旋轉(zhuǎn)光闌。靠近舞臺底部，一個能夠旋轉(zhuǎn)的圓盤，旋轉(zhuǎn)光圈（也叫快門），光圈有大小不一的圓孔，稱為孔。直徑分別為2、3、6、12、16mm。旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)隔膜。光闌上的每個光闌都可以與光孔對齊，通過不同大小的孔徑可以調(diào)節(jié)光強。 (4) Reflector Reflector為可隨意旋轉(zhuǎn)的雙面鏡，直徑為50mm。一側(cè)是平的，另一側(cè)是凹的。它的作用是通過光孔反射來自任何方向的光。平面鏡反光能力弱，光線強時使用，凹面鏡反光能力強，光線弱時使用。反射器通常一側(cè)是平面鏡，另一側(cè)是凹面鏡。它安裝在冷凝器下方，可以水平和垂直方向旋轉(zhuǎn)。反射器的作用是使光源發(fā)出的光或自然光到達聚光器。使用聚光鏡時一般使用平面鏡，不用時使用凹面鏡；光線強時使用平面鏡，光線弱時使用凹面鏡。觀察后，反射器應(yīng)垂直放置。 (5)照明光源顯微鏡的照明可以使用自然光源或人造光源。自然光源光來自天空，被白云反射。請勿使用陽光直射。 2.人造光源①。對人造光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強度；光源不能產(chǎn)生過多的熱量。 ②常用人造光源：顯微鏡燈；熒光燈 (6) 濾光器安裝在光源和聚光器之間。作用是讓選定的某一波段的光通過，而吸收其他光，即改變光的光譜成分或減弱光的強度。分為兩類：過濾器和液體過濾器。 (7) 蓋玻片和載玻片蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當平整，無氣泡和劃痕。選擇無色、透明性好的，使用前洗凈。蓋板玻璃的標準厚度為0.17±0.02mm。如果不使用蓋板玻璃或蓋板玻璃厚度不合適，都會影響成像質(zhì)量。載玻片標準厚度為1.1±0.04mm，一般使用范圍為1-1.2mm。如果太厚，會影響冷凝器的性能，如果太薄，則容易破裂。